Окисли́тельное фосфорили́рование — метаболический путь, при котором энергия, образовавшаяся при окислении питательных веществ, запасается в митохондриях клеток в виде АТФ. Хотя различные формы жизни на Земле используют разные питательные вещества, АТФ является универсальным соединением, в котором запасается энергия, необходимая для других метаболических процессов. Почти все аэробные организмы осуществляют окислительное фосфорилирование. Вероятно, широкому распространению этого метаболического пути способствовала его высокая энергетическая эффективность по сравнению с анаэробным брожением.

При окислительном фосфорилировании происходит перенос электронов от соединений-доноров к соединениям-акцепторам в ходе окислительно-восстановительных реакций. В ходе этих реакций выделяется энергия, которая далее запасается в виде АТФ. У эукариот эти окислительно-восстановительные реакции осуществляются несколькими белковыми комплексами, локализованными во внутренней митохондриальной мембране, а у прокариот они располагаются в межмембранном пространстве клетки. Этот набор связанных белков составляет электрон-транспортную цепь (ЭТЦ). У эукариот в состав ЭТЦ входит пять белковых комплексов, в то время как у прокариот её составляют множество различных белков, работающих с различными донорами и акцепторами электронов.

Энергия, выделяющаяся при движении электронов по ЭТЦ, используется для перекачки протонов из митохондриального матрикса через внутреннюю мембрану в межмембранное пространство. При этом увеличивается электрохимический градиент, то есть возрастает разность концентраций протонов и разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней мембраны, и тем самым накапливается энергия, которая высвобождается при возвращении протонов в матрикс. Обратно в матрикс протоны проходят через особый белковый комплекс — АТФ-синтазу; сам процесс перемещения протонов по их электрохимическому градиенту получил название хемиосмос. АТФ-синтаза использует выделяющуюся при хемиосмосе энергию для синтеза АТФ из АДФ в реакции фосфорилирования. Эта реакция запускается при вращении части АТФ-синтазы, которое поддерживается благодаря потоку протонов: таким образом, АТФ-синтаза работает как вращающийся молекулярный мотор.

Хотя окислительное фосфорилирование обеспечивает энергией клетки и поддерживает жизнь клеток, в ходе этого процесса также образуются активные формы кислорода, в частности, супероксид и пероксид водорода. Они способствуют образованию в клетках свободных радикалов, которые разрушают белки и причиняют вред клеткам, приводя к болезням и старению. Ферменты окислительного фосфорилирования являются мишенями для многих биологически активных веществ и ядов, которые подавляют их активность.

Окислительное фосфорилирование следует отличать от субстратного фосфорилирования, при котором АТФ синтезируется не за счёт энергии переноса электронов и протонов по цепи переносчиков, а при фосфорилировании АДФ до АТФ при отрыве фосфата от соединений с высоким потенциалом переноса фосфата.